荧光原位杂交FISH技术服务

FISH技术：荧光标记的原位杂交技术

　　1974年Evans将染色体显带技术和染色体原位杂交联合应用，提高了定位的准确性。20世纪70年代后期人们开始探讨荧光标记的原位杂交，即FISH技术。1981年Harper成功地将单拷贝的DNA序列定位到G显带标本上，标志着染色体定位技术取得了重要进展。20世纪90年代，随着人类基因组计划的进行，由于绘制高分辨人类基因组图谱的需要，FISH技术得到了迅速的发展和广泛应用。

　　1．原理

　　将核酸探针的某一种核苷酸标记上报告分子如生物素、地高辛，可利用该报告分子与荧光素标记的特异亲和素之间的免疫化学反应，经荧光检测体系在镜下对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。

  

肺肿瘤细胞FISH

　　2．实验流程

　　FISH样本的制备→探针的制备→探针标记→杂交→染色体显带→荧光显微镜检测→结果分析。

　　3．特点

　　原位杂交的探针按标记分子类型分为放射性标记和非放射性标记。用同位素标记的放射性探针优势在于对制备样品的要求不高，可以通过延长曝光时间加强信号强度，故较灵敏。缺点是探针不稳定、自显影时间长、放射线的散射使得空间分辨率不高、及同位素操作较繁琐等。采用荧光标记系统则可克服这些不足，这就是FISH技术。FISH技术作为非放射性检测体系，具有以下优点:1、荧光试剂和探针经济、安全；2、探针稳定，一次标记后可在两年内使用；3、实验周期短、能迅速得到结果、特异性好、定位准确；4、FISH可定位长度在1kb的DNA序列，其灵敏度与放射性探针相当；5、多色FISH通过在同一个核中显示不同的颜色可同时检测多种序列；6、既可以在玻片上显示中期染色体数量或结构的变化，也可以在悬液中显示间期染色体DNA的结构。

　　缺点：不能达到100%杂交，特别是在应用较短的cDNA探针时效率明显下降。

　　4．应用

　　该技术不但可用于已知基因或序列的染色体定位，而且也可用于未克隆基因或遗传标记及染色体畸变的研究。在基因定性、定量、整合、表达等方面的研究中颇具优势。

根生实验流程

一、探针及标本的变性
（1）探针变性：将探针在75℃怛温水浴中温育5min，立即置0℃，5～10min，使双链DNA探针变性。

（2）标本变性：

①将制备好的染色体玻片标本于50℃培养箱中烤片2～3h。（经Giemsa染色的标本需预先在固定液中退色后再烤片）。

②取出玻片标本，将其浸在70～75℃的体积分数70%甲酰胺/2×SSC的变性液中变性2～3min。
③立即按顺序将标本经体积分数70%、体积分数90%和体积分数100%冰乙醇系列脱水，每次5min，然后空气干燥。
二、杂交:
将已变性或预退火的DNA探针10mL滴于已变性并脱水的玻片标本上，盖上18×18盖玻片，用Parafilm封片，置于源潮湿暗盒中37℃要交过夜（约15～17h）。由于杂交液较少，而且杂交温度较高，持续时间又长，因此为了保持标本的湿润状态，此过程在湿盒中进行。
三、洗脱：此步骤有助于除去非特异性结合的探针，从而降低本底。
（1）杂交次日，将标本从37℃温箱中取出，用刀片轻轻将盖玻片揭掉。
（2）将已杂交的玻片标本放置于已预热42～50℃的体积分数50%甲酰胺/2×SSC中洗涤3次，每次5min。
（3）在已预热42～50℃的1×SSC中洗涤3次，每次5min。
（4）在室温下，将玻片标本2×SSC中轻洗一下。
四、杂交信号的放大:
（1）在玻片的杂交部位加150mL封闭液I，用保鲜膜覆盖，37℃温育20min。
（2）去掉保鲜膜，再加150mL avidin-FITC于标本上，用保鲜膜覆盖，37℃继续温育40min。
（3）取出标本，将其放入已预热42～50℃的洗脱液中洗涤3次，每次5min。
（4）在玻片标本的杂交部位加150mL封闭液II，覆盖保鲜膜，37℃温育20min。
（5）去掉保鲜膜，加150mL antiavidin于标本上，覆盖新的保鲜膜，37℃温育40min。
（6）取出标本，将其放入已预热42～50℃的新洗脱液中，洗涤3次，每次5min。
（7）重复步骤（1）、（2）、（3），再于2×SSC中室温清洗一下。
（8）取出玻片，自然干燥。
（9）取200mL PI/antifade染液滴加在玻片标本上，盖上盖玻片。
五、封片:
    可采用不同类型的封片液。如果封片中不含有Mowiol（可使封片液产生自封闭作用），为防止盖片与载片之间的溶液挥发，可使用指甲油将盖片周围封闭。封好的玻片标本可以在-20～-70℃的冰箱中的暗盒中保持数月之久。
六、荧光显微镜观察FISH结果:
先在可见光源下找到具有细胞分裂相的视野，然后打开荧光激发光源，FITC的激发波长为490nm。细胞被PI染成红色，而经FITC标记的探针的探针所在位置发出绿色荧光。由于本实验使用的是Y染色体上的特异序列，因此在男性外周血染色体标本的杂交中呈阳性，即使在末分裂的细胞中，也可以观察到明显的杂交信号。照相记录实验结果